Introdução à Investigação Laboratorial
Código
101026
Unidade Orgânica
NOVA Medical School | Faculdade de Ciências Médicas
Créditos
15
Professor responsável
Prof. Doutor Luis Miguel Nabais Borrego
Língua de ensino
Português
Objectivos
Pretende-se que os alunos tomem conhecimento de metodologias diversas e técnicas laboratoriais que sejam abrangentes e cuja diversidade permita desenhar estratégias de investigação para questões científicas concretas, com aplicação das técnicas laboratoriais com interesse translacional.
Pretende-se que possam adquirir a formação teórica mínima (aceite por lei) em ciências de animais de laboratório e um curso prático de experimentação animal, que permitirá completar a formação mínima exigida por lei para obter creditação para investigação no modelo animal.
No domínio laboratorial pretende-se que adquiram competências específicas e trabalhem «hands-on» com técnicas expeditas e modernas de Citometria de Fluxo, Epigenética, Proteómica, Genética Molecular e Anatomia Patológica.
Os objectivos específicos de cada Módulo estão indicados campo do "conteúdo".
Pré-requisitos
Conteúdo
A UC de Introdução à Investigação Laboratorial está organizada em vários Módulos, sendo apenas obrigatório o Módulo de Segurança e Boas práticas laboratoriais. Cada doutorando poderá escolher o número de módulos que achar conveniente até perfazer um mínimo de 15 ECTS. Os conteúdos e temas de cada Módulo são apresentados abaixo, individualmente.
Segurança e Boas Práticas Laboratoriais
(2 ECTS)
Regras básicas de segurança em laboratório. Equipamento de segurança: protecção individual e protecção colectiva. Símbolos e frases de risco. Armazenamento e manipulação de produtos químicos. Risco biológico e biossegurança: classificação de microrganismos em grupos de risco, prevenção e minimização de riscos na manipulação de microrganismos. Níveis de segurança biológica: requisitos para laboratórios com diferentes níveis de segurança biológica; requisitos para laboratórios com manipulação de animais. Requisitos particulares de segurança: Microbiologia, Culturas celulares, Biologia molecular, RIA. Gestão e eliminação de resíduos: resíduos químicos; resíduos biológicos; processos de descontaminação. Risco ocupacional e acidentes de trabalho. Boas práticas e qualidade no laboratório. Legislação aplicável a laboratórios de investigação. Normas de Certificação e Acreditação de laboratórios de ensaio. Validação de métodos. Noções de Controlo Interno de Qualidade e Avaliação Externa da Qualidade / Ensaios interlaboratoriais. Normas de utilização e segurança de material de laboratório: câmaras de fluxo laminar, pipetas, centrífugas, agitadores e sonicadores, estufas e equipamentos de frio, autoclaves. Acidentes de trabalho: modos de acção. Como evitar contaminações / processos de descontaminação (em culturas celulares, Biologia molecular, equipamentos e instalações). Gestão e eliminação de resíduos.Manual de segurança do laboratório. Validação de métodos e ensaios. Aplicação de regras de Controlo de Qualidade.
Objetivos:
Este módulo pretende que os doutorandos:
- Operadores atuais, ou futuros, do laboratório, se familiarizem com as normas básicas de segurança;
- Reconheçam e fiquem preparados para atuar perante os riscos a que venham a estar expostos;
- Conhecendo os princípios básicos das boas práticas laboratoriais, ganhem a capacidade para gerir e garantir a qualidade dos resultados nos projetos de investigação em que venham a estar envolvidos.
Organização Pedagógica / Metodologias de ensino:
Aulas teóricas e teórico-práticas com execução de exercícios e protocolos laboratoriais.
Bibliografia e Material de apoio:
Apresentações das aulas disponibilizadas pelos docentes.
-WHO (2004) Manual de Segurança Biológica em Laboratório - versão portuguesa. 3.ª Edição.
- European Committee for Standardization (2011) Laboratory biorisk management CEN CWA 15793.
- ILO/WHO (2005) Joint ILO/WHO guidelines on health services and HIV/AIDS.
- Despacho n.º8835/2001, de 28 de Fevereiro - Manual das Boas Práticas Laboratoriais.
Informação sobre a avaliação dos alunos:
Exame final de escolha múltipla, com questões do âmbito da componente teórica e da componente teórico-prática.
Experimentação Animal Teórico
(3 ECTS)
Este módulo inclui os seguintes conteúdos para roedores, lagomorfos e peixes: anatomia e fisiologia, alimentação e nutrição, manutenção e acomodação, comportamento e ambiente, bem-estar animal e sinais de perturbação, padronização e manipulação genética, métodos de identificação, gestão de colónias, estatuto sanitário e microbiológico, biocontenção e bioexclusão como prevenção/controlo de infecções, transporte de animais, anestesia e analgesia, cuidados pré e pós cirúrgicos e princípios básicos de cirurgia,
administração de substâncias e colheita de amostras, eutanásia, ética e os 3 Rs, integridade científica e desenho experimental, saúde e segurança no contacto com animais, legislação e recomendações europeias e nacionais.
Objetivos:
Desenhado para futuros utilizadores de animais para fins experimentais, pretende dar a formação teórica de base para poderem vir a usar animais de acordo com as recomendações Europeias de bem-estar animal. Este módulo, fornecido pela Sociedade Portuguesa de Ciências em Animai de Laboratório (SPCAL) ao abrigo do procolo com a FCM, garante a formação teórica exigida por lei (Decreto-Lei n.o 113/2013) para obter creditação para a realização das funções a) Realizac¸a~o de procedimentos em animais; c) Prestac¸a~o de cuidados aos animais; e d) Occisa~o de animais. Este módulo complementa a formação prática estas funções, ficando os participantes habilitados para vir a utilizar animais em futuros projetos de investigação apenas após a obtenção de creditação junto da Direção Geral de Alimentação e Veterinária.
Organização Pedagógica / Metodologias de ensino:
E-learning.
Bibliografia e Material de apoio:
Será indicada em cada sessão do curso.
Informação sobre a avaliação dos alunos:
Teste escrito com 60% de respostas corretas.
Introdução à Cultura de Células Animais
(3 ECTS)
A cultura de células tem uma importância incontestável, tendo-se afirmado como uma ferramenta essencial para quem trabalha em investigação fundamental e aplicada, nomeadamente em campos como a Biologia Celular e Molecular, Fisiologia, Biotecnologia ou Medicina. O uso de células em cultura representa cada vez mais uma importante alternativa à experimentação animal. Este módulo dá uma preparação teórica e prática de base na técnica de cultura de células animais e foi desenhado para pessoas com pouca ou nenhuma experiência em culturas celulares. Pode ser útil para pessoas envolvidas em investigação fundamental ou aplicada.
Citometria de Fluxo
(4 ECTS)
Princípios e fundamentos da Citometria de Fluxo. Tipos de amostra e seu processamento. Estratégias de análise e suas aplicações. Apresentação de resultados e sua interpretação. Aplicações da Citometria de Fluxo: Imunofenotipagem celular e citometria policromática. Proliferação celular. Estudos de apoptose. Avaliação do ciclo celular. Ensaios funcionais. Cell sorting. Ensaios Multiplex: tecnologia Luminex e tecnologia CBA (Cytometric Bead Array). Identificação dos elementos constituintes do citómetro de fluxo, calibrações e compensações. Como construir um painel em função do teste pretendido. Como construir um template de aquisição e de análise. Que software utilizar? Anticorpos monoclonais utilizados para definir linhagem hematopoiética. Utilização de outros reagentes em Citometria de Fluxo. Número de eventos a adquirir de acordo com a questão formulada. Estudo das subpopulações linfocitárias em sangue periférico (células T, B e NK). Identificação das restantes populações leucocitárias. Exemplos de avaliação do estádio maturativo das células hematopoiéticas. Ensaios funcionais: desgranulação de basófilos, fagocitose e metabolismo oxidativo das células fagocitárias. Isolamento de populações celulares (Cell sorting). Apoptose e ciclo celular.
Objetivos:
Pretende-se que os doutorandos:
- Se familiarizem com técnicas e ensaios atualmente disponíveis nestas áreas;
- Conheçam o funcionamento básico de um citómetro de fluxo;
- Ganhem conhecimentos para montar e validar ensaios envolvendo a Citometria de Fluxo;
- Ganhem as ferramentas necessárias para a montagem de estratégias de análise adequadas aos ensaios efetuados;
- Aprofundem o conhecimento em Imunoensaios, ganhando espírito crítico para a sua utilização na resolução de problemas clínicos concretos.
Organização Pedagógica / Metodologias de ensino:
Aulas teóricas e teórico-práticas com execução de exercícios e protocolos laboratoriais.
Bibliografia e Material de apoio:
Apresentações das aulas disponibilizadas pelos docentes.
Shapiro, HM. (2003) 4th ed. Practical Flow Cytometry. Willey-Liss. ISBN 0-471-41125-6.
OGorman, M., Donnenberg, A. (2008) 2nd ed. Handbook of Human Immunology. CRC Press. ISBN 0-8493-1984-6.
Informação sobre a avaliação dos alunos:
Exame final de escolha múltipla, com questões do âmbito da componente teórica e da componente prática (70%), e elaboração de trabalho com aplicação prática dos conhecimentos ministrados à sua área de estudo (30%).
Experimentação Animal Prático
(3 ECTS)
Rotinas de manutenção de animais escolha entre diferentes tipos de cama, ninho e materiais de enriquecimento ambiental., utilização de caixas metabólicas, transporte e acondicionamento. Inclui uma visita a um Biotério fazendo a integração dos conteúdos do módulo teórico. Nas sessões práticas inclui-se o treino de manuseamento e contenção além da utilização de diferentes métodos de marcação permanente e temporária de acordo. O respeito pelos princípios de bem-estar animal e facilidade para o operador acompanham todas as sessões. Serão treinadas várias vias de colheita de amostras biológicas e várias vias de administração de substâncias. Pretende-se que os participantes fiquem com bases para saber escolher e executar correctamente os procedimentos.
Objetivos:
Desenhado para futuros utilizadores de animais para fins experimentais, pretende dar a formação prática de base para poderem vir a usar animais de acordo com as recomendações Europeias de bem-estar animal. Este módulo, garante a formação prática exigida por lei (Decreto-Lei n.o 113/2013) para obter creditação para a realização das funções a) Realizac¸a~o de procedimentos em animais; c) Prestac¸a~o de cuidados aos animais; b) Concec¸a~o de procedimentos e projetos; e d) Occisa~o de animais em peixes, murganho e rato. Este módulo complementa a formação teórica específica para cada função, ficando os participantes habilitados para vir a utilizar animais em futuros projetos de investigação apenas após a obtenção de creditação junto da Direção Geral de Alimentação e Veterinária.
Organização Pedagógica / Metodologias de ensino:
Presencial com aulas teórico/práticas e práticas com contacto com animais vivos.
Bibliografia e Material de apoio:
Apresentações das aulas teórico práticas.
Legislação Nacional - Decreto-Lei n.o 113/2013.
Informação sobre a avaliação dos alunos:
60% verificação da execução dos procedimentos práticos e 40% em teste escrito. Requisito de ter pelo menos 50% de resposta corretas no teste escrito e 90% de sucesso na realização dos procedimentos práticos.
Epigenética e Cancro
(3 ECTS)
Noções gerais dos mecanismos epigenéticos. Abordagem e integração das alterações epigenéticas que ocorrem em neoplasias.
Compreensão da importância dos inibidores de desacetilases de histonas e de metilases de DNA, como agentes de regulação epigenética, no tratamento de neoplasias.
Execução de várias técnicas de biologia molecular que permitirão avaliar o efeito de modulador epigenético dos inibidores de desacetilases de histonas em células de carcinoma de ovário.
Espectrometria de massa como técnica de identificação de alterações epigenéticas ao nível do DNA e das histonas.
Avaliação da viabilidade celular de linhas de neoplasias malignas humanas expostas a inibidores de desacetilases de histonas e de metilases de DNA, nomeadamente vorinostat e 5-aso-desoxicitidina.
Avaliação da modulação da expressão génica através de PCR quantitativo e western blotting.
Ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) para a identificação de fatores de transcrição envolvidos na ativação da expressão de HNF1.
Objetivos:
Revisão dos conceitos básicos de regulação epigenética, nomeadamente a importância da metilação do DNA e da metilação e acetilação de histonas na regulação da expressão génica.
Contacto com técnicas de modulação, identificação e quantificação da expressão de genes.
Formulação de questões no contexto de alterações epigenéticas em oncobiologia.
Integração e adaptação das técnicas ao contexto experimental.
Aquisição de conhecimentos ao nível do tratamento e apresentação de resultados.
Treino de comunicação científica oral e escrita.
Organização Pedagógica / Metodologias de ensino:
Nas aulas teóricas serão ministrados os conceitos básicos da regulação epigenéticas e as alterações observadas no contexto da oncobiologia. Nas aulas práticas será desenvolvido trabalho experimental que visa a indução e deteção de alterações epigenéticas com recurso a modelos in vitro. Os resultados obtidos serão apresentados em formato de comunicação científica oral e escrita.
Aulas teóricas e práticas.
Apresentação de comunicação científica oral e escrita.
Exame escrito.
No âmbito desta unidade curricular serão treinadas as várias formas de comunicação científica (escrita e oral) bem como será requerida a participação dos alunos na planificação do trabalho experimental que decorrerá nas aulas práticas e subordinado a um tema pré-definido, no contexto da regulação epigenética em oncobiologia.
Bibliografia e Material de apoio:
A bibliografia será disponibilizada ao longo da UC e os alunos serão orientados no sentido de realizarem pesquisa bibliográfica.
Informação sobre a avaliação dos alunos:
A aquisição dos conceitos teóricos no âmbito da regulação epigenética será avaliada não só no exame teórico como também na apresentação dos resultados obtidos nas aulas práticas sob a forma de comunicação oral ou em painel.
Os alunos têm obrigatoriamente que assistir a 2/3 das aulas práticas e obter uma classificação final mínima de 9,5 valores.
Proteómica Clínica
(3 ECTS)
Compreensão da importância dos projetos de sequenciação de genomas no desenvolvimento da proteómica, uma metodologia transversal às diversas áreas das ciências da vida. Revisão dos progressos tecnológicos associados à proteómica e de como estes tornaram possível a caracterização de milhares de proteínas em sistemas biológicos complexos. A análise qualitativa e quantitativa de proteínas, nomeadamente das suas modificações pós-tradução, como uma ferramenta essencial na compreensão da variabilidade dos sistemas biológicos. A aplicação da proteómica na biomedicina: um instrumento na pesquisa de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico de doenças e descoberta de novos alvos terapêuticos.
Técnicas de separação de proteínas em larga escala, nomeadamente o 2D-PAGE. Identificação de proteínas candidatas a biomarcadores através da espectrometria de massa: compreensão dos conceitos básicos - Peptide Mass Fingerprint (PMF) e MS/MS (sequenciação). Aspectos essenciais de um espectrómetros de massa, nomeadamente o MALDI-TOF/TOF. Bases de dados e análise bioinformática dos resultados. Exemplos da aplicação da proteómica no contexto de doenças pulmonares crónicas (doença pulmonar obstrutiva crónica, asma e fibrose quística). Ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) para a identificação de factores de transcrição envolvidos na activação da expressão de HNF1.
Genética Molecular: aplicação ao diagnóstico clínico
(3 ECTS)
A sequenciação do genoma humano; Genes Humanos; Doenças humanas: patologia molecular. Doenças Cromossómicas. Hereditariedade mendeliana e outros padrões de hereditariedade; Doenças mendelianas complexas: doença Charcot-Marie-Tooth e miocardiopatia hipertrófica; Doenças multifactoriais. Técnicas de diagnóstico genético; Genótipo e perfil genético; Tipos de mutações (pontuais,inserções, delecções e repetições); Estratégias de identificação de mutações; Mutações desconhecidas (single strand conformation polymorphism, denaturating gradient gel electrophoresis, denaturating high performance liquid chromatography, sequenciação de ADN, HRM). Mutações conhecidas (Allele Specific Oligonucleotide, Amplification-Refractory Mutation System, Oligonucleotide ligation assay e Primer-introduced restriction analysis; hibridação reversa; TaqMan, IPLEX- MALDI-TOF). Grandes delecções/amplificações (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, Array-CGH); Sequenciação de genomas em larga escala. Aplicações em diagnóstico clínico. miRNA e siRNA e suas aplicações à clínica. Extracção de ADN a partir de diferentes amostras biológicas; Genotipagem simples e em larga escala. Outras técnicas moleculares para a identificação de mutações no genoma humano. Cariótipo.
Objetivos:
Pretende-se com este módulo que os alunos adquiram uma série de conhecimentos relativos à aplicabilidade da genética molecular na área da medicina, em particular focando novas abordagens no diagnóstico e na terapeutica de doenças humanas de caracter genético ou multifactorial tal como o cancro. A nanomedicina na prática clinica: Nanodiagnóstico e Nanoterapêutica. Drug delivery.
Organização Pedagógica / Metodologias de ensino:
Aulas expositivas. Slides em powerpoint. Discussão de artigos (em grupo) do interesse dos discentes na área da UC.
Bibliografia e Material de apoio:
Principles of Medical Genetics. 3rd Edition, Thomas D. Gelehrter, Francis S. Collins, and David Ginsburg, USA
Human Molecular Genetics. 3rd edition, Strachan and Read. Wiley & Sons Inc, USA
Cancer Biology Raymond W Ruddon. Oxford University Press. 2007
Cancer Nanotechnology: Principles and Applications in Radiation Oncology. Sang Hyun Cho, Sunil Krishnan, CRC Press, 2013-
Understanding Nanomedicine: An Introductory Textbook, Rob Burgess, CRC Press, 2012
Medical Nanotechnology and Nanomedicine. Harry F. Tibbal, CRC Press, 2010
Informação sobre a avaliação dos alunos:
A avaliação deste módulo será realizada pela elaboração de uma frequência final com incidência na componente teórica e prática (perguntas de escolha múltipla) (100% nota final).
Anatomia Patológica Células, Tecidos e Doença
(5 ECTS)
Estudo dos mecanismos e manifestações morfológicas comuns e importantes das doenças humanas. Adaptação celular e Senescência, Lesão e Morte Celular, Inflamação e Neoplasia. Observação de preparações histopatológicas em microscópico óptico de multi-observadores. Prática de selecção de amostras e de processamento de amostras para estudo histo-patológico; execução e de interpretação das técnicas de imuno-histoquímica e de hibridação in situ. Introdução à microscopia electrónica. Exemplos de estudos translacionais usando a morfologia.
Bibliografia
A Bibliografia/Material de Apoio considerada pertinente para cada Modulo são os indicados no campo do "conteúdo".
Método de ensino
Os Módulos estão organizados em aulas teóricas, teórico-práticas, e práticas, pretendendo-se uma grande componente desta última vertente. As aulas teóricas serão ministradas com o apoio de métodos de suporte informático. As aulas teórico-práticas serão leccionadas com o auxílio de meios audiovisuais, bem como pela exemplificação de técnicas laboratoriais. As aulas práticas decorrerão em ambiente laboratorial com execução prática pelos alunos.
A organização de cada Módulo, bem como as metodologias de ensino e avaliação, estão a cargo do responsável de cada módulo e vêm indicadas no campo do "conteúdo".
Método de avaliação
Cada UC definirá as formas e os critérios de avaliação a considerar (exames, participação nas aulas, capacidade de execução técnica, relatório) sendo que os mesmos vêm indicados no campo do "conteúdo".
Os alunos terão de obter aproveitamento a todos os Módulos em que estejam inscritos. No caso de reprovação num dos Módulos, desde que aprovado na componente prática (quando aplicável), o aluno apenas terá que efectuar nova prova escrita até aprovação no respectivo Módulo. A aprovação final na UC depende da aprovação em todos os Módulos nos quais o doutorando se tenha inscrito, não sendo permitidas trocas de Módulos após o início do ano lectivo, nem na eventualidade de o aluno ficar retido na UC por apenas um Módulo, que transita para o ano lectivo seguinte.